共聚焦顯微鏡是一種利用??激光點光源與空間針孔濾波技術(shù)??，實現(xiàn)對樣品??光學(xué)“斷層掃描”成像??的高分辨率顯微儀器。它通過物理手段排除離焦雜散光，顯著提升圖像對比度和分辨率，尤其適用于厚樣品的三維重構(gòu)與活體動態(tài)觀測。
??一、核心原理??
??1點照明 & 點探測??
激光束聚焦為??微小光點??(衍射極限級)照射樣品。
發(fā)射光(熒光/反射光)通過??針孔，僅允許??焦平面信號??通過探測器，阻擋離焦背景光。
??2光學(xué)切片??
通過逐點掃描樣品平面，并逐層移動聚焦位置，獲得??系列二維薄層圖像??。
疊加所有切片可重建??三維立體結(jié)構(gòu)??。?
二、 共聚焦顯微鏡核心優(yōu)勢
1.出色的光學(xué)切片能力與三維重建：
消除非焦面模糊，獲得樣品內(nèi)部特定深度的清晰圖像。
通過Z軸步進掃描，獲取一系列二維“光學(xué)切片”，經(jīng)計算機處理可精確重建樣品的三維結(jié)構(gòu)。這是研究細胞器空間分布、組織形態(tài)、材料表面/內(nèi)部結(jié)構(gòu)的基石。
2.高分辨率與高對比度：
X-Y分辨率接近光學(xué)衍射極限(~200 nm)，Z軸分辨率(~500 nm)顯著優(yōu)于寬場顯微鏡(~1000-2000 nm)。
“針孔效應(yīng)”極大抑制背景噪聲，提升圖像信噪比(SNR)和對比度，尤其對厚樣本或弱熒光信號至關(guān)重要。
3.強大的多色熒光成像能力：
利用多種不同激發(fā)波長的激光器和精密的熒光分光探測系統(tǒng)(如聲光可調(diào)濾光器AOBS， 二向色鏡， 光譜探測器)，可同時對同一樣品中的多個不同標(biāo)記物進行成像。
高級光譜拆分技術(shù)(線性拆分)可有效分離發(fā)射光譜高度重疊的熒光染料，實現(xiàn)更精確的多色分析。
4.活細胞成像工具：
點掃描(尤其共振掃描)和轉(zhuǎn)盤共聚焦為觀察活細胞內(nèi)快速、動態(tài)的生理過程提供了可能。
結(jié)合環(huán)境控制系統(tǒng)(溫控、CO?、濕度)，可在接近生理條件下對細胞進行長時間(數(shù)小時甚至數(shù)天)觀察，研究細胞遷移、分裂、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、藥物反應(yīng)等。
5.定量分析平臺：
熒光強度定量分析(如蛋白表達量、離子濃度變化)。
共定位分析(研究分子間的空間關(guān)系)。
熒光漂白后恢復(fù)(FRAP)及其變種：研究分子流動性、相互作用、細胞器連通性。
熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)：檢測分子間相互作用距離(<10 nm)。
熒光壽命成像(FLIM)：提供分子微環(huán)境信息(如pH、離子濃度、分子結(jié)合狀態(tài))，是定量FRET的重要手段。
熒光相關(guān)光譜(FCS)/熒光互相關(guān)光譜(FCCS)：在極微小體積內(nèi)分析分子擴散系數(shù)、濃度、相互作用。
三、核心組件與技術(shù)
1.激光光源：
多譜線激光器： 提供多個固定波長的激發(fā)光(如405nm, 488nm, 561nm, 640nm)。
白光激光器(WLL)： 提供連續(xù)可調(diào)的激發(fā)波長，極大提升實驗靈活性。
飛秒/皮秒激光器： 用于多光子激發(fā)。
2.掃描系統(tǒng)：
振鏡掃描器： 核心組件，控制激光束在X-Y方向精確掃描。
共振掃描器： 用于高速掃描。
轉(zhuǎn)盤掃描器： 用于轉(zhuǎn)盤共聚焦。
3.探測系統(tǒng)：
光電倍增管(PMT)： 傳統(tǒng)探測器，靈敏度高。
混合探測器(HyD)： 結(jié)合PMT高增益和雪崩二極管(APD)高量子效率、低噪聲。
雪崩光電二極管(APD)： 速度快，用于FLIM/FCS等。
科學(xué)級sCMOS相機： 用于轉(zhuǎn)盤共聚焦、光片、寬場超分辨。
4.分光系統(tǒng)：
聲光可調(diào)濾光器(AOTF)： 快速、精確調(diào)節(jié)激光強度和波長。
聲光分束器(AOBS)： 利用聲光效應(yīng)進行高效、快速、無串?dāng)_的分光(替代二向色鏡，徠卡TCS核心)。
二向色鏡/濾光片輪： 傳統(tǒng)分光元件。
光譜探測器： 收集發(fā)射光的光譜信息，用于光譜拆分。
5.精密物鏡：
高數(shù)值孔徑(NA)油鏡、水鏡、甘油鏡、硅油鏡、空氣鏡。
復(fù)消色差(APO)物鏡。
長工作距離(WD)物鏡。
專用物鏡(如活細胞專用、多光子專用、TIRF專用)。
6.軟件平臺：
核心控制： 硬件控制(激光、掃描、探測、載物臺、Z軸)、圖像采集。
圖像處理與分析： 去噪、反卷積、3D/4D可視化、定量分析(強度、共定位、形態(tài)、FRAP、FRET、FLIM、FCS等)。
實驗管理： 多維實驗、宏編程、自動化。
代表軟件： 尼康NIS-Elements， 徠卡LAS X， 蔡司ZEN， 奧林巴斯cellSens。
四、 共聚焦顯微鏡應(yīng)用領(lǐng)域
1.生命科學(xué)研究：
細胞生物學(xué)： 細胞器結(jié)構(gòu)與動態(tài)(線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體、細胞骨架)、細胞分裂、細胞遷移、囊泡運輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞間通訊。
神經(jīng)科學(xué)： 神經(jīng)元形態(tài)(樹突棘、軸突)、突觸結(jié)構(gòu)與功能、神經(jīng)回路、鈣成像、神經(jīng)遞質(zhì)釋放。
發(fā)育生物學(xué)： 胚胎發(fā)育、組織形成、器官發(fā)生(活體成像)。
免疫學(xué)： 免疫細胞遷移、免疫突觸形成、病原體-宿主細胞相互作用。
微生物學(xué)： 細菌/真菌形態(tài)、生物膜結(jié)構(gòu)、病原體侵染過程。
藥理學(xué)與藥物開發(fā)： 藥物靶點定位、藥物細胞內(nèi)分布、藥效評估(如細胞凋亡、增殖)、高通量篩選(轉(zhuǎn)盤共聚焦)。
2.臨床醫(yī)學(xué)：
病理學(xué)： 組織切片的高分辨率、高對比度成像(尤其熒光標(biāo)記的特定蛋白或核酸)，輔助診斷。
眼科： 角膜、視網(wǎng)膜成像。
輔助生殖： 胚胎質(zhì)量評估(非侵入性)。
3.材料科學(xué)：
表面形貌與粗糙度分析： 高精度三維表面成像。
薄膜與涂層分析： 厚度測量、均勻性、缺陷檢測。
聚合物科學(xué)： 相分離結(jié)構(gòu)、結(jié)晶形態(tài)、添加劑分布。
半導(dǎo)體與微電子： 器件結(jié)構(gòu)、線路檢查、缺陷定位。
地質(zhì)與礦物學(xué)： 礦物成分分布、孔隙結(jié)構(gòu)分析。
法醫(yī)學(xué)： 微量物證(纖維、油漆、粉塵)的精細結(jié)構(gòu)觀察和成分分析。
